ELISA試劑盒細胞培養(yǎng)清處理方法匯總

　　ELISA試劑盒中，細胞培養(yǎng)上清的處理方式需根據(jù)檢測目標(biāo)是?分泌性蛋白?還是?細胞內(nèi)成分?區(qū)分操作，以下是具體方法匯總及注意事項，可參考：

　　一、檢測分泌性成分

　　該方法適用于檢測細胞分泌到培養(yǎng)基中的目標(biāo)蛋白，操作步驟如下：

　　確認細胞密度：待貼壁/懸浮細胞密度達到?60%~90%?時，即可進行樣本采集。

　　收集上清：吸取適量細胞培養(yǎng)上清到無菌離心管中，建議采集體積不小于500μL。

　　離心除雜：在?2℃~8℃條件下?，以對應(yīng)參數(shù)離心去除細胞碎片和雜質(zhì)：

　　常規(guī)方案：1000×g離心20分鐘

　　短時間方案：2500rpm離心5~10分鐘

　　其他方案：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘

　　轉(zhuǎn)移分裝：將澄清上清轉(zhuǎn)移至新離心管，棄掉底部沉淀;按單次使用量分裝，避免反復(fù)凍融。

　　檢測保存：取適量上清直接進行ELISA檢測，剩余樣本-20℃或-80℃凍存;若保存后出現(xiàn)沉淀，使用前需再次離心去除沉淀。

　　二、檢測細胞內(nèi)成分

　　若目標(biāo)蛋白存在于細胞內(nèi)，需先收集細胞再破碎提取上清，操作步驟如下：

　　收集細胞：

　　貼壁細胞?：吸走原有培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化后，4℃ 2500rpm離心5~10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

　　懸浮細胞?：直接將培養(yǎng)基和細胞轉(zhuǎn)移離心管，4℃ 2500rpm離心5~10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

　　細胞破碎：

　　向細胞沉淀中加入含蛋白酶抑制劑(PMSF終濃度1mmol/L)的裂解液：一般每10^6個細胞加入150~250μL中強度RIPA裂解液(不推薦含高濃度NP-40、Triton X-100或DTT的裂解液，會抑制抗原抗體反應(yīng))，冰上裂解30~60分鐘，也可配合超聲破碎：功率150~300W，裂解1~2秒間歇20~30秒，重復(fù)3~5個循環(huán)。

　　離心取上清：4℃條件下10000rpm離心10分鐘，上清即為待測樣本。

　　檢測保存：立即分裝，可直接檢測或-80℃凍存。

　　三、通用注意事項

　　蛋白濃度測定：? 細胞培養(yǎng)基中含有胎牛血清等雜蛋白，不建議用BCA法測定總蛋白濃度，會導(dǎo)致結(jié)果偏差。

　　保存禁忌：? 必須分裝凍存，禁止反復(fù)凍融樣本，會導(dǎo)致蛋白降解，影響檢測準(zhǔn)確性;-20℃可保存1個月，-80℃可保存3個月以上。

　　雜質(zhì)處理：? 凍存樣本融化后若出現(xiàn)沉淀，必須再次離心去除沉淀再進行檢測，避免雜質(zhì)干擾結(jié)果。

　　若實驗需要酸化處理樣本：100μL細胞培養(yǎng)上清+20μL 1mol/L HCl，輕微混合后室溫孵育10分鐘，再加入20μL 1.2N NaOH/0.5M HEPES中和后即可檢測。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考，具體可咨詢技術(shù)老師!

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